摘要：作为一种近年来引起广泛关注的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统以其操纵简便、工作高效以及通用性广等优势成为近年来最受欢迎的基因敲除体系。目前该技术在拟南芥、人体细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因编辑中得到成功应用。但在灵芝中尚未有相关报道。本实验以灵芝G20为研究对象，成功构建Crispr/Cas9基因敲除体系。ura3基因编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，若该酶失活，灵芝则无法生长，除非在加入尿嘧啶或尿苷的培养基中，根据这一特性便于在灵芝中定向筛选，本实验选择ura3基因作为基因编辑的目标靶点，以便后期通过ura3基因进行目的菌株的筛选。
关键词：Crispr/Cas9；灵芝；基因敲除；URA3基因
Construction of Cas9 genomic editing system of Ganoderma by URA3 gene
Abstract： As a kind of genomic editing technique which has aroused widespread concern in recent years. The CRISPR/CAS9 system has been the most popular gene knockout system in recent years by its advantages of simplicity, efficiency and versatility. At present, the technology is successfully applied in the gene editing of Arabidopsis, human cell, zebra fish, mice and bacteria. But there is no relevant report in Ganoderma lucidum. In this experiment, Ganoderma lucidum G20 as the research object, successfully constructed Crispr/Cas9 gene knockout system. URA3 gene encoding Whey 5-Phosphoric acid decarboxylase, if the enzyme inactivation, Ganoderma lucidum can not grow, unless in the addition of uracil or glucoside in the medium, according to this feature to facilitate the directional screening in Ganoderma lucidum, this experiment selected URA3 gene as the target of gene editing, in order to later through the URA3 gene for the purpose of screening strains.
Key words: Crispr/Cas9；Ganoderma；gene knockout；URA3 genes
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1供试菌株2
1.1.2培养基2
1.1.3主要试剂与溶液3
1.1.4主要仪器设备3
1.2方法 3
1.2.1Crispr/Cas9基因组编辑体系的构建3
1.2.1.1Cas9质粒的提取3
1.2．1.219-T质粒的构建4
1.2.2Cas9质粒、19-T质粒共转化5
2结果与分析5
2.119-T质粒构建结果5
2.1．1RB质粒、LB质粒酶切酶连结果5
2.1．2RB-LB质粒、EGFP质粒酶切酶连结果6
2.2Cas9质粒、19-T质粒共转化结果8
3讨论 11
3.1CRISPR/Cas9载体在真菌中的应用已有成功案例 11
3.2不足之处 11
致谢11
参考文献12
利用URA3基因进行灵芝Cas9基因组编辑体系的构建
引言
灵芝（Ganoderma lucidum）是著名的大型药用真菌，具有极高的营养价值和药用价值，在我国和东南亚国家有着悠久的应用历史。灵芝三萜类化合物（又称灵芝酸 Ganoderic acid）是灵芝的主要药用成分之一，具有抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等活性。灵芝酸含量的多少是目前衡量灵芝质量高低的重要指标。然而目前灵芝中灵芝酸含量普遍较低，导致灵芝相关产品开发难度大，产品价格高。因此，提高灵芝酸产量，是进一步提升灵芝药用价值和商业价值的重要发展方向。通过系统研究灵芝酸生物合成的调控网络，可以拓展人类对萜烯类化合物生物合成机制及生理意义的认识，提高灵芝酸的产量，提升灵芝药用价值和商业价值。
近年来兴起的基因组定点编辑技术包括以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs), TALE 核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs),以及近一年来兴起的一项新技术——Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统这些人工核酸酶都可以在DNA 靶位点产生 DNA 双链断裂 (Double strandbreaks, DSBs)。ZFN和TALEN分别通过锌指蛋白和类转录激活因子效应物识别DNA序列，并在特定位点对DNA进行切割，形成双链断裂，随后在非同源末端连接修复机制下形成随机的多个碱基的插入或删除，从而实现基因敲除。ZFNs 和 TALENs 这两项技术在实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长。而CRISPR拥有简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，有利于在实验室推广使用。 利用URA3基因进行灵芝Cas9基因组编辑体系的构建:http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_205828.html