1．1．2．3  MM培养基    筛选培养基：葡萄糖20 g，L-天冬氨酸 2g，酵母提取物2g，蛋白胨2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·0.46g，K2HPO4 1g，甘露醇109.3g，维生素B1 0.125mg/L，5-FOA400 ng/μl，尿苷0.1g/L在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将10g琼脂加入液体培养基中，再定容至1000 mL，115 ℃下灭菌30 min后使用。

1．1．2．4  PDA、PDB培养基    PDB：（液体培养基）马铃薯200 g，葡萄糖20g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用；PDA（固体培养基）将15g琼脂加入液体培养基中，再定容至1000 mL，115 ℃下灭菌30 min后使用。

1．1．3  主要试剂与溶液

1．1．3．1  主要试剂    75%乙醇、无水乙醇、酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）、液氮、RNase、PCR Buffer、dNTPs、rTaq酶、异丙醇、脂质体、溶壁酶等

1．1．3．2  主要溶液    溶液Ⅰ:葡萄糖 50mmol/L、Tris-HCl(PH8.0) 25mmol/L、EDTA(PH8.0) 10 mmol/L；溶液Ⅱ：(现配现用) 2mol/L NaOH0.5 mL、10%SDS 0.5mL、ddH2O 4 mL；溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾 60mL、冰醋酸 11.5mL、ddH2O 28.5mL

1．1．4  主要仪器设备

PCR仪、电泳仪、-80℃冰箱、水平恒压电泳仪、凝胶成像仪、28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、摇床、超净工作台、移液枪、磁旋搅拌器、离心机、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅等。

1．2  方法

1．2．1  Crispr/Cas9基因组编辑体系的构建

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行灵芝基因组编辑体系的构建。利用酶切酶连技术构建含有URA3基因同源臂以及EGFP的19-T质粒，使其与已有的Cas9质粒一起转化灵芝原生质体，若Cas9发挥作用，则含有同源臂的19-T-Simple质粒会与被切割的URA3基因发生同源重组，使EGFP基因插入到灵芝URA3基因中，使其长度改变，以便用PCR对转化子进行筛选。

利用已选取好的灵芝URA3基因的同源臂（R臂、L臂）质粒、EGFP质粒及其引物；首先用XbaⅠ和NdeⅠ双酶切R臂质粒和L臂质粒，得到切开一个缺口的L臂质粒和被切下的R臂片段；连接上一步的酶切产物，得到LB-RB质粒；用XbaⅠ和SacⅠ双酶切LB-RB质粒和EGFP质粒；LB-RB质粒LB与RB之间被切开缺口，EGFP片段被切下；连接上一步的酶切产物，得到LB-EGFP-RB质粒即19-T质粒。

1．2．1．1  Cas9质粒提取

1．2．1．1．1  质粒提取

（1）取100μL保种的菌液接种到6 ml LB+A+ 液体培养基，37 ℃ 过夜振荡培养（10-12h）；（2）菌液分装到1.5 ml离心管中，12000 rpm 离心30s；（3）弃上清，加入100 μL溶液Ⅰ（冰冷），剧烈振荡混匀；（4）加入现配置的200 μL 溶液Ⅱ温和上下颠倒混匀，放置在冰上2min；（5）加入150 μL 溶液Ⅲ温和振荡10 s，-20℃放置10 min；（6）12000 rpm 4 ℃ 离心10 min，取上清至新离心管；（7）加等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀， 12000 rpm 4 ℃ 离心3 min，吸弃下层；（7）12000 rpm 4 ℃ 离心5 min取上清至新离心管；（8）加入2倍上清体积的无水乙醇，振荡混匀，于-20℃中放置10 min。（9）12000 rpm 4 ℃ 离心5 min，弃上清；（10）加入200 μL 70 % 乙醇轻轻振荡漂洗， 12,000 rpm 4 ℃ 离心1 min，弃上清；（11）略离心，弃上清，晾干；（12）加30μL ddH2O溶解沉淀，室温静置5分钟；（13）并加入1μL RNase。

1．2．1．1．2  质粒PCR

取适量质粒进行PCR 反应。反应体系如下，总体积为25μL： 

10×PCR buffer          2.5μL

dNTP                 2μL

Primer-F              1μL 利用URA3基因进行灵芝Cas9基因组编辑体系的构建(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_205828.html