Primer-R              1μL

ddH2O                17.3μL

rTaq                  0.2μL

菌液                 1μL

PCR反应体系：（25μL/管）

94 ℃ 10 min，94℃  10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃  30 s，30个循环，72 ℃  5 min， 72 ℃  30h。反应结束后进行电泳检测。-20℃保存Cas9质粒。

1．2．1．2  19-T质粒的构建   

利用实验室中已经构建好的含有双酶切位点的R臂质粒、L臂质粒、EGFP质粒连通过酶切酶连将EGFP和两个同源臂相连，构成19-T质粒。

1．2．1．2．1  双酶切RB、LB质粒

用XbaⅠ和NdeⅠ双酶切R臂质粒和L臂质粒，得到切开一个缺口的L臂质粒和被切下的R臂片段。质粒酶切体系如下：（10μL）

LB质粒/RB质粒        7μL

XbaⅠ                 1μL

NdeⅠ                 1μL

10×M buffer            1μL 

37℃温箱中放置3h，电泳检测，并切胶回收。

1．2．1．2．2  切胶回收

在紫外灯箱内迅速切下含有LB第1条条带和RB第4条条带的凝胶置于1.5 ml离心管中，称凝胶重量；按凝胶3 ml/g加入Buffer B2，置45 ℃ 水浴5-10 min，完全溶解凝胶；将该溶液转至吸附柱离心管中，10000 rpm 离心1 min；用500 μL 的Wash Solution 离心洗涤吸附柱10000 rpm 离心1 min,重复洗涤一次，弃滤液。空甩10000 rpm 离心1 min，弃废液。加入30 μL ddH2O，37 ℃ 静置2 min，10000 rpm 离心1 min，回柱再离心一次，即得到纯化的PCR 产物。跑胶检测，并进行酶连实验，剩余部分于-20℃保存。

1．2．1．2．3  连接酶切产物构建LB-RB质粒

将纯化回收得到的产物连接到一起，混匀，4 ℃ 放置12h，构成LB-RB质粒。片段连接体系如下：（10μL体系）‘

片段LB(大)             1μL

片段RB(小)             7μL

10×T4 buffer            1μL 

DNA连接酶            1μL

1．2．1．2．4  LB-RB质粒转化

连接产物全部加入到200μL 感受态细胞悬液中，冰浴30 min；42 ℃ 水浴热激45 s；快速转移至冰上放1 min；加入100μL LB 液体LB培养基（不含抗生素），37℃摇床缓慢振摇培养1 h；将培养物涂布在LB 琼脂平板上（含100 g/ml Amp），37 ℃ 培养过夜。