CRISPR即规律成簇间隔短回文重复序列，它是细菌用以保护自身，对抗外源基因的免疫系统。经研究发现，它也是一种高效的基因编辑技术，可以用来敲除、插入、激活或关闭目的基因，包括人体、斑马鱼、细菌、酿酒酵母、拟南芥、小鼠以及植物内的基因，由此说明CRISPR系统可以成为一种可普及的基因编辑技术迄今为止我们发现了三种不同类型的CRISPR系统，其中最常用的为II型，它最为简便，主要元件为Cas9蛋白以及向导RNA(sgRNA)，同时也是目前生物学家了解最透彻的CRISPR系统。

Cas9蛋白是一种含有两个酶切活性位点，可以切割DNA分子的核酸酶，每个活性位点的功能是剪切DNA双链中的一条链。Cas9最初先与crRNA和tracrRNA结合为复合物，进而依赖PAM序列与目标基因结合，形成RNA-DNA杂交体系，然后对目的基因两条连进行切割，使目的基因的双链断裂。我们几乎可以利用 Cas9蛋白对任何一个基因进行遗传学改造，因为PAM碱基序列简单，仅为5’-NGG-3’，自然界中大多数生物的DNA序列都含有大量PAM片段靶位点。我们对Cas9蛋白的应用也很多样，既能够通过Cas9蛋白的核酸酶活性将DNA双链切割，使基因失活；也能够在切断DNA双链后在切割位点插入我们所需的外源基因。

基因敲除(knockout)是常用于研究调控机制的一种方法。基因敲除-----一种针对目的基因修饰的技术，通过基因改造，令特定基因丧失某些功能，进而研究该基因对相关表型造成的改变，从而预测该基因的生物学功能。其中CRISPR基因敲除技术拥有简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，在实验室易于推广使用。

URA3基因是酵母V号染色体上的一个基因，它能编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，若乳清苷5-磷酸脱羧酶失活，酵母就无法生长，除非在培养基中加入尿苷或尿嘧啶。向营养缺陷菌株中转化进URA3基因，这些营养缺陷株便能生长（阳性选择），相反，向培养基中加入5-FOA（5-氟乳清酸），正常原养型酵母细胞的乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-FOA转化为有毒物质，而其产物5-氟尿嘧啶能导致细胞死亡（阴性选择）。

利用URA3基因的这种特性，可以筛选突变体。sgRNA和Cas9 装载在载体上，导入灵芝中，导入的CRISPR/Cas系统识别和降解靶基因- URA3基因，可以通过双重标志判断突变体：缺失URA3基因的细胞需加入尿苷或尿嘧啶才能生长；由于缺失URA3基因，所以加入5-FOA并不会产生有毒物质，细胞正常生长。

利用CRISPR系统建立灵芝基因敲除体系，具有灵活性的编辑功能，可以通过更换sgRNA从而改变作用靶点。为下一步在灵芝中敲除ura3基因，进一步研究灵芝基因组功能打下基础。通过更换sgRNA来敲除特定的灵芝基因，再根据表型的改变研究基因功能及调控途径。该体系不仅在研究灵芝基因功能方面具有应用前景，同时也为今后进一步培育灵芝三萜高产菌株奠定基础。此外，该技术的成功应用为进一步揭示灵芝三萜生物合成的调控机制积累了资料，具有十分重要的理论意义。

1  材料与方法 

1．1  材料

1．1．1  供试菌株    G20菌种保存于南京农业大学生命科学学院应用真菌实验室。1．1．2  培养基

1．1．2．1  CYM培养基    液体发酵培养基：麦芽糖10g，葡萄糖20 g，酵母提取物2g，蛋白胨2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·4.6g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将10g琼脂加入液体培养基中，再定容至1000 mL，115 ℃下灭菌30 min后使用。

1．1．2．2  LB培养基    液体发酵培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将15g琼脂加入液体培养基中，再定容至1000 mL，115 ℃下灭菌30 min后使用。 利用URA3基因进行灵芝Cas9基因组编辑体系的构建(2):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_205828.html