摘 要：CCaMK是调控豆科植物根瘤以及菌根共生形成的重要信号传导因子，酵母双杂交技术可研究CCaMK与其他相关蛋白间的互相作用。本研究从豆科模式植物苜蓿幼根中提取出总RNA并反转录为cDNA，经过PCR扩增获得目的基因CCaMK与YH57，克隆至T载体。然后以酶切方式将目的基因分别连入酵母双杂交GAL4系统的pAD和pBD载体，构建表达载体pAD-GAL4-OEGmYH57 和pBD-GAL4-OECCaMK。接下来将它们共转化至酵母菌YRG-2中，最后通过SC缺素使苜蓿YH57与CCaMK蛋白间的互作关系得到可视化。实验结果显示实验组与阴性对照组保持一致，只有极少量小的单克隆产生，最终初步判定GmYH57和CCaMK在酵母体系中不存在相互作用，不能启动下游报道基因的转录。本研究缩小了CCaMK的候选互作蛋白的范围，为进一步从候选库中寻找CCaMK的互作靶蛋白作铺垫。
CCaMK is an important signal transduction factor regulating nodules and mycorrhizal symbiosis in legumes. Yeast two-hybrid technology can study the interaction between CCaMK and other related proteins. In this study, the total RNA was extracted from the young roots of leguminous plants and reverse transcribed into cDNA. The target genes CCaMK and YH57 were obtained by PCR and cloned into T vector. Then, the target gene was ligated into the pAD and pBD vectors of the yeast two-hybrid GAL4 system by enzyme digestion, and the expression vectors pAD-GAL4-GmYH57 and pBD-GAL4-CCaMK were constructed. Next, they were co-transformed into the yeast YRG-2. Finally, the interaction between the YH57 and CCaKK proteins was visualized by the SC deficiency. The experimental results show that the experimental group is consistent with the negative control group, only a very small number of small monoclonal production, and ultimately concluded that GmYH57 and CCaMK in the yeast system does not interact, can not start the transcription of downstream reporter genes. This study narrowed the range of CCaMK candidate interaction proteins and provided a basis for further searching for CCaMK interaction target proteins from candidate libraries.
关键词：蒺藜苜蓿; CCaMK; 酵母双杂交; 蛋白质; 相互作用
Keyword: Medicago truncatula; CCaMK; Yeast two-hybrid; Protein; Interactions
目 录
引言..4
一 材料与试剂.5
1.1主要材料..5
1.1.1植物材料...5
1.1.2菌株和质粒5
1.2主要设备..5
1.3.主要试剂..5
1.3.1化学试剂.5
1.3.2酶和引物.5
1.3.3试剂盒.6
1.4主要配方..6
1.4.1缓冲液..6
1.4.2培养基.6
二 研究方法..6
2.1苜蓿基因YH57的克隆...6
2.1.1苜蓿总 RNA的提取（Trizol法）.6
2.1.2 cDNA反转录7
2.1.3苜蓿基因全长的克隆...7
2.1.4 回收目的基因DNA片段...8
2.1.5 T载体连接9
2.1.6 T- GmYH57转化大肠杆菌...9
2.1.7 质粒DNA的提取...9
2.2 酵母双杂交...10
2.2.1 真核表达载体的构建10
2.2.2重组质粒的共转化与筛选 ... 11
三 结果与分析11
3.1 苜蓿基因YH57的克隆结果.11
3.2酵母双杂交结果13
3.2.1真核表达载体的构建结果13
3.2.2重组质粒的共转化与筛选结果.15
四 讨论17
参考文献.18
致谢..18
引言
生物固氮是地球上规模最大的天然氮肥加工工厂，能将空气中的氮转变为植物可以利用的有机氮源。在当今日益紧张的能源供应和世界人口不断增长的情况下，生物固氮在减少环境污染和能源消耗、建立生态平衡、促进农业可持续发展等方面发挥着重要作用。随着现代基因工程的兴起和生物技术的发展，生物固氮已被纳入“国际生物学计划”的关键研究内容，成为生命科学研究的一个重要命题。现有的众多生物固氮方式中主要以豆科植物与根瘤菌的共生固氮为典型，其固氮量占生物界总固氮量的七成以上[1]，是农业生产中最主要的氮素来源。豆科植物不仅是重要的粮食作物和牧草资源[2]，为人类和牲畜提供了大量蛋白质，同时因其富含油脂，还是重要的能源物质。但就现状而言，人类对豆科植物的利用率还比较低，甚至不到1%，可见豆科植物仍存在巨大的生产潜能和营养价值有待我们进一步开发利用。 酵母双杂交验证GmYH57与CCaMK蛋白的相互作用:http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206632.html