近几年来，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）其遗传转化效率高、生长周期短、基因组小、自花授粉、固氮效率高、可被侵染的根瘤菌范围广等特点[3]，迅速成为新进的豆科模式植物并广泛应用于基因组学的研究，帮助研究人员获得了大量具有特殊表型的豆科植物突变体。通过对苜蓿突变体的研究，发现MtDMI3基因编码一种依赖钙调蛋白的蛋白激酶(Calcium and Calmodulin-dependent Protein Kinase，CCaMK)，是调控豆科植物根瘤以及菌根共生形成的重要信号传导因子[4]。CCaMK蛋白一般由1个激酶区、1个自抑制区和3个EF-hand组成[5]。CCaMK的EF-hand区可与游离Ca2+的结合诱导CCaMK自磷酸化[6]，从而增强了CCaMK与钙调素(Calmodulin，CaM)的结合，后一种结合会解除自抑制区的抑制，使其激酶活性得以表达，诱导根毛表皮细胞发生形态变化，最终形成根瘤。因此，充分了解CCaMK与互作蛋白间的具体作用关系是研究豆科植物共生固氮的必经之路。

在探索蛋白质-蛋白质相互作用的研究中，由Fields[7]等人提出的酵母双杂交系统在应用上表现出显著的技术优势。这是一种既简捷又高效的鉴定真核细胞基因的方法，它不仅可以检测已知蛋白质之间的相互作用[8]，还可以结合cDNA文库一起使用，发现能与已知蛋白相互作用的未知蛋白。该系统功能的实现取决于转录活化因子GAL4上两个相互独立的结构域，分别是DNA结合结构域（GAL4-BD）和转录激活结构域（GAL4-AD）。单独的GAL4-AD和GAL4-BD都不足以激活下游基因的转录反应，只有当它们表达的蛋白间发生相互作用时，才表现出完整的转录活性，进而启动报道基因的表达。

酵母双杂交系统在被广泛应用中得到不断改进和发展，衍生了基于不同适用范围和不同物种的杂交技术，其灵敏度和特异性也得到了显著提高，解决了大量基因在生物功能上的相关性问题。因此，本研究将借助酵母双杂交技术，对苜蓿GmYH57与CCaMK蛋白间的相互作用关系进行鉴定，为调控根瘤形成过程中的信号转导奠定基础，进而优化豆科植物生物固氮机制。

一 材料与试剂

1.1主要材料：

1.1.1植物材料：

野生型蒺藜苜蓿幼根，由所在实验室提供。

1.1.2菌株和质粒：

（1）菌株：大肠杆菌菌株Trans1、酵母菌株YRG-2均由所在实验室保存。

（2）载体：T载体（pEASY®-Blunt Zero Cloning）、pAD-GAL4-2.1载体、pAD-GAL4-OE IPD3和pBD--GAL4-OECCaMK表达载体、pBD-GAL4-OECCaMK表达载体，均由所在实验室构建并提供。

1.2主要设备：

微量分光光度计，凝胶成像仪，小型电泳仪，漩涡震荡仪，掌上离心机，4℃离心机，冷冻离心机，恒温摇床NHY-111C；超净工作台；30℃培养箱；高压灭菌锅、无菌操作台。

1.3.主要试剂：

1.3.1化学试剂：

液氮、10×H Buffer、5×Buffer；Yeast Extract（酵母提取物）购于 OXOID；Agar B 购于生工； 琼脂糖购于 BIOWEST；DNA Marker购于 BIOMED；卡那霉素（Kan.）和 氨苄青霉素（Amp），10×loading Buffer，EB；ddH2O、DMSO、LB、1M LiAc、50% PEG3350、鲑鱼油Boiled ss-Cawier DNA均由所在实验室配置并提供。

1.3.2酶和引物：

（1） 酶：Taq聚合酶，Sal I和Xho I限制性内切酶， T4 DNA连接酶、PCR酶（2×HLingene PCR Master Mix）均购于 TaKaRa公司。 

（2）引物：OEYH57-F/R由所在实验室根据GenBank公布的苜蓿基因序列，结合酵母表达载体pAD-GAL4-2.1的阅读框和多克隆位点进行设计并提供。

OEYH57-F：5′-CCG CTCGAG ATGGCATCATCAGGTGAAGTTG--3′

（Xho I）

OEYH57-R：5′-GC GTCGAC CTAATGAGCACTTGGTGCGTC--3′ 酵母双杂交验证GmYH57与CCaMK蛋白的相互作用(2):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206632.html