（Sal I）

1.3.3试剂盒：

（1）康为世纪纯化植物RNA试剂盒（RNA pure Plant Kit）和HiFiScript cDNA 第一条链合成试剂盒cw2569购于 TaKaRa公司。

（2）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（包含Buffer S1、S2、S3、W1、W2和洗脱液Eluent试剂）和AxyPrep DNA胶回收试剂盒（包含Buffer DE-A、DE-B、W1、W2和洗脱液Eluent试剂）购自康宁生命科学有限公司。

（3）高纯度PCR产物纯化试剂盒（High Pure PCR Product Purification Kit）购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4主要配方

1.4.1缓冲液：

（1）50×TAE Buffer：称取242g Tris和37.2g Na2EDTA·2H2O于57.1ml醋酸充分搅拌溶解。

（2）1×TAE：取20ml 50×TAE Buffer，加入980ml纯净水，混匀。

1.4.2培养基：

（1）大肠杆菌培养基：称取20g LB和12-16g Agar(固体)，加ddH2O至1L搅拌混匀。

（2）YPAD酵母培养基：分别称取1.0g Yeast extract、2.0g Peptone、2.0g Glucose、10.0mg Adenine hemisμl lphate、1.667g Agar（固体），加dd H2O至100ml搅拌混匀，调节pH至5.8。

（3）SC（-Trp/-Leu/-His/-Ura）四缺培养基：分别称取2.664g Yeast （w/o amino acids）、8.0g Glucose、0.33g  Drop-out Mix（0.0112g Ura、0.0184g His、0.0184g Leu、0.0276g Trp）、6.668g Agar，加dd H2O至400 ml搅拌混匀。

二 研究方法

2.1苜蓿基因YH57的克隆

2.1.1苜蓿总 RNA的提取（Trizol法）

本研究采用康为世纪的纯化植物RNA试剂盒（RNA pure Plant Kit）进行苜蓿总RNA的提取实验，操作步骤如下：

（1）用液氮将研钵充分预冷，放入从野生型苜蓿幼根1g研磨成粉末，趁粉末自然液化之前，迅速至1.5 ml离心管中；

（2）加入600 μl Buffer RL（使用前加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀，使样品充分裂解；

（3）将上述得到的干净裂解液缓慢转移至2 ml离心管中，在4℃、12000 rpm的条件下离心2min；

（4）将离心后的上清转移至新的1.5 ml RNase-Free离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速振荡混匀；

（5）将上述混合液转移至2ml含吸附柱的收集管中，在4℃、10000 rpm的条件下离心15s，弃滤液，并将吸附柱置回收集管中；

（6）向吸附柱加入350μl Buffer RW1，在4℃、10000 rpm的条件下离心1 min，弃掉滤液，并将吸附柱置回收集管中；

（7）配置DNase I混合液：52 μl RNase-Free Water、8 μl 10X Reaction Buffer、20 μl  DNase I，每个样品总计80 μl；

（8）向吸附柱中加入80 μl DNase I混合液，20~30℃孵育15min；重复操作步骤（6）一次；

（9）再向吸附柱中加入500μl Buffer RW2（使用前已加无水乙醇），在4℃、10000 rpm的条件下离心15s，弃滤液，并将吸附柱置回收集管中，再重复操作一次；

（10）在4℃、12000 rpm的条件下空转离心1min，将吸附柱置于一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，室温吹干10min；

（11）向吸附柱膜中央滴加30μl RNase-Free Water，室温放置1 min，在4℃、10000 rpm的条件下离心1min，得到RNA模版，保存于-80 oC备用。