自动影像分析菌落计数仪 法国Interscience 公司

一次性无菌注射器（30 mL） 上海楚定分析仪器有限公司

1．3 试验方法

菌种活化：取出冻存于-80℃的肠炎沙门氏菌标准株（Salmonella enteritidis standard strains, ATCC 13702）、肠炎沙门氏菌分离株（Salmonella enteritis）、阿贡纳沙门氏菌分离株（Salmonella argonne）、婴儿沙门氏菌分离株（Salmonella infantile）、鼠伤寒沙门氏菌分离株（Salmonella typhi）。室温溶解，分别吸取10 μL到5 mL TSB液体培养基，37℃下培养20 h，划线接种于XLD平板，37℃培养20 h后挑取典型单菌落接种到5 mL 的TSB液体培养基中，37℃下培养20-24 h。

取活化后（108CFU/mL）菌液0.2 mL于6.5 mL TSB培养基，混匀后，37℃下培养18 h，使细菌处于对数生长后期，菌液经12000 r/s离心5 min，除去离心后的上清液，用0.9%生理盐水对菌体沉淀进行洗涤，洗涤三次后，用适量生理盐水将菌体沉淀悬浮，使菌液浓度约为109  CFU/mL。

1.3.1 沙门氏菌的高渗透压应激试验

试验准备：按照要求配制TSB 液体培养基，将其分装到10 mL离心管中，其中每管分装6.5 mL (作为TSB管)；配制0.9%的生理盐水，每管分装4.5 m到10 mL离心管(作为盐水管)；配制含量为8%氯化钠的TSB培养基，分装入10 mL离心管中，每管4.5 mL(作为8%氯化钠TSB管)；TSA培养基等，121℃灭菌15 min备用。

TSA培养基灭菌后，降至50-60℃左右，倒入90 mm培养皿中，室温冷却凝固备用；称取适量XLD培养基，用去离子水溶解后，加入转子，用封口膜将其封口后放置于磁力搅拌加热器上进行搅拌加热，当培养基沸腾1min左右停止加热。室温冷却至50-60℃左右时倒入90mm培养皿中冷却凝固备用。

1.38 g的磷酸二氢钠于1000 mL去离子水溶解，制成PBS缓冲液A液；3.58 g的十二水和磷酸氢二钠于1000 mL去离子水溶解，制成PBS缓冲液B液；然后A液和B液按28:72的体积比混合，测量其PH值，再用A液和B液进行调节使其PH值达到7.2，根据每管4.5 mL的量，分装在10 mL离心管中（以下称稀释管），121℃灭菌15 min，冷却备用；

非高渗处理:活化后菌液，取0.5 mL加入4.5mL盐水管稀释，菌浓度为108，再取0.5 mL加入4.5 mL无菌盐水管中进行梯度稀释，分别稀释至菌体浓度达到102，为保证菌落计数有效，选取102、103、104浓度，分别取100 µL涂布于TSA平板，每种菌设6个重复，每个浓度两个平行，37℃中培养20-24 h。培养结束后取出，利用菌落计数仪对平板上的菌落数进行计数，得出非高渗透压处理菌株在培养基平板上的生长情况。

高渗透压应激处理：活化后的菌液取0.5 mL加入4.5 mL盐水管中梯度稀释，菌浓度约为108后，吸取0.5 mL加入4.5 mL 8%氯化钠TSB管中，每种菌配制出20管总体积为5 mL的菌液。37℃下培养4个时间点（1 h、1.5 h、2 h、3 h），每个时间点5个重复。取出，进行10倍梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4），为确保计数结果范围合适，本试验中采用的涂布稀释梯度为10-2、10-3、10-4三个梯度，将10-2、10-3、10-4梯度的稀释液各取100 µL分别涂布于TSA平板，每个浓度两个平行，37℃中培养20-24 h。再利用菌落计数仪进行计数，得出在高渗透压条件下处理菌株在TSA培养基平板上的生长情况。

1.3.2 沙门氏菌的酸性应激试验

试验准备：配制TSB 液体培养基，分装到10 mL离心管中，每管6.5 mL (作为TSB管)；配制0.9%的生理盐水每管分装4.5 mL到10 mL离心管中(作为盐水管)；配制TSB液体培养基；TSA培养基等，121℃灭菌15分钟备用。灭菌TSB培养基冷却后，用浓盐酸调节至PH=3，再进行分装，每管4.5 mL（作为PH3 TSB管）。 耐受环境应激多样性的研究(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_205988.html