本实验以拟南芥AtKIX8基因启动子作为研究对象，克隆获得此基因启动子长、短片段分别一段，分析了其中所包含的潜在调控元件；构建启动子-GUS报告基因表达载体，获得转基因纯合启动子报告株系；运用转基因报告系研究拟南芥AtKIX8基因的组织表达模式和潜在的转录调控机制。为更深层探究拟南芥AtKIX8基因的功能机理与调控机制指明方向。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验采用野生型拟南芥Columbia-0，农杆菌菌株GV3101，利用含GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301。在Takara宝生物工程（滨城）有限责任公司采买克隆试剂盒、限制性内切酶；T4 DNA连接酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞盒、逆转录试剂盒（TransScript First-Strand cDNASynthesis）购买于北京全式金生物技术有限责任公司；所有引物购买于自生工生物工程（沪）股份有限责任公司；其余材料都买于北京康为世纪生物科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥AtKIX8基因启动子序列预测分析

依据拟南芥信息网（http://www.arabidopsis.org/）其中的AtKIX8（At3g24150）DNA序列结构及其所在染色体的位置讯息，将DNA转录起始位点前3000 bp的DNA序列作为预测的启动子序列，利用线上程序PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对这一序列展开转录调节元件分析。

1.2.2 拟南芥AtKIX8基因启动子克隆及植物表达载体构成

以AtKIX8基因转录起始位点前3000 bp的DNA序列设计长、短2个片段的克隆引物，含Kpn I酶切位点的长片段上游引物为：5'-GGTACCGCAAGAGTCAGCCTAACAAGTA-3'；短片段的上游引物为：5'-GGTACCGCTGTCAAAGTTGCTGAAGGT-3'；设计含Nco I酶切位点的长、短片段下游通用引物为：5'-CCATGGGGAAATGGAAATGGTGTGATTC-3'。

运用野生型的拟南芥基因组基因作为参照模板，PCR扩增得到2个目的片段，反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃长、短片段各延伸3分钟、1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟。产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收纯化。纯化产物经T-A克隆、菌落PCR检测和质粒KpnI/NcoI双酶切验明后送生工生物工程（沪）股份有限责任公司测序。测序正确的克隆载体及空表达载体pCAMBIA1301进行KpnI/NcoI双酶切，分别回收目的片段及空表达载体大片段进行连接，重组质粒经验证后通过冻融法分别转入根癌农杆菌GV3101[11]。

1.2.3 拟南芥培养及基因转化筛选

拟南芥种子经表面消毒后无菌水冲洗5次，点入B5培养基，4 ℃放置2~3天后解除种子休眠再移入光照进行培养。培养条件为：22 ℃恒温，湿度60%，光照强度10000 lx，光周期使用16小时光照/8小时黑暗的长日照条件。7~10 天后将幼苗移入土中培养，至3~4周后开花，即可用于基因转化。拟南芥基因转化使用花序浸润法[12]。转基因阳性植株的筛选使用12.5 mg/L潮霉素（hygromycin）。抗性植株经过3代的筛选分离，获取纯合的转基因系。

1.2.4 转基因植株的GUS组织化学染色

利用X-gluc（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid）对转基因株系进行GUS蛋白组织化学染色。整株转基因幼苗或部分成熟植株器官在X-gluc终溶液（1 mg/ml X-gluc，0.5 mM高铁氰化钾，0.5 mM亚铁氰化钾，0.1% Triton X-100，50 mM磷酸缓冲液，10 mM EDTA，pH 7.0）中37 ℃染色过夜，使用70%酒精脱色直至叶绿素全部消失，拍照记录植株染色情况。