1.2.3测定MeJA处理前后灵芝酸含量

（1）MeJA处理：对WT、CK1、CK2、30684i-5、30684i-7进行发酵培养，发酵1天后分别向培养基中添加MeJA处理和乙醇对照处理。

（2）收集菌丝：处理后继续培养，再发酵6 天后收集菌丝。使用滤网过滤出发酵好的菌丝球并用水冲洗，除去菌丝球表面的培养基和多糖等物质；将清洗好的菌丝球均匀厚度的平铺于玻璃纸上，然后置于铺有三层吸水纸的架子上，60 ℃烘箱中烘干。

（3）提取灵芝酸：将烘干后的菌丝置于研钵中研磨成均匀的细小粉状，对应编号存放于2 mL离心管中；称取等质量（0.2 g）菌丝粉末溶10 mL容量瓶中，95%乙醇定容至10 mL；将容量瓶封好超声2 h（每间隔20 min取出混匀一次，同时注意超声时水温度的变化，若水温升高需及时更换）；超声结束后，每个样品吸取上清液1 mL于1.5 mL离心管中，4000 rpm，离心10 min；取上清液400 μL于1.5 mL离心管中；每个样品设置3个重复，每个管子中加入100 μL样品（对照组的管子中加入100 μL95%的乙醇溶液）；每根管子依次加入200 μL香草醛、500 μL高氯酸，盖盖后60 ℃水浴20 min；热水浴结束后取出进行冰水浴冷却；冷却后以此添加5 mL冰醋酸，充分混匀后测定吸光值。

（4）分光光度计测定：使用空白对照进行调零，550 nm处依次测定吸光值，并记录。

1.2.4测定MeJA处理前后ROS含量

（1）添加MeJA处理：在倒平板之前,在培养基中加入MeJA处理和乙醇对照处理。

（2）进行平板实验：在添加了MeJA处理和乙醇对照处理的PDA固体培养基中，接种WT、CK1、CK2、30684i-5、30684i-7。培养3-4 天后，在合适的位置进行插片，然后继续在28 ℃培养箱中培养。

（3）荧光显微镜观察：按照1.2.3中方法，待菌丝长至载玻片上后，进行相应的荧光染料染色，然后使用荧光显微镜观察并拍照，对所拍照片进行数据处理，最后计算ROS含量的变化。

1.2.5清除沉默转化子中的ROS

（1）添加清除剂处理：在倒平板之前,在培养基中分别加入N-乙酰半胱氨酸（NAC）、维生素C(Vc)、抗坏血酸（CAT）处理。

（2）进行平板实验：在添加了清除剂处理和未处理的PDA固体培养基中，接种30684i-5、30684i-7。培养3-4 天后，在合适的位置进行插片，然后继续在28 ℃培养箱中培养。

（3）荧光显微镜观察：按照1.2.3中方法，待菌丝长至载玻片上后，进行相应的荧光染料染色，然后使用荧光显微镜观察并拍照，对所拍照片进行数据处理，最后计算ROS含量的变化。

1.2.6清除沉默转化子中ROS后，灵芝酸含量测定

（1）添加清除剂处理：对灵芝沉默转化子30684i-5、30684i-7进行发酵培养，第四天时分别加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、维生素C(Vc)、抗坏血酸（CAT），清除沉默转化子中ROS。处理一，取0.2 mL母液浓度为0.5 M/L的NAC于100 mL培养基中，即终浓度为1 mM/L（1NAC）；处理二，取1 mL母液浓度为0.5 M/L的NAC于100 mL培养基中，即终浓度为5 mM/L（5NAC）；处理三，取0.4 mL母液浓度为0.5 mM/L的Vc于100 mL培养基中，即终浓度为2 mM/L ；处理四，取500 灵芝bHLH型转录因子GL30684对灵芝酸生物合成的调控研究(4):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206475.html