PDA培养基（固体）：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，定容1 L，115 ℃灭菌30 min。

CYM培养基（液体）：1%的麦芽糖，2%的葡萄糖，0.2%的酵母提取物（Yeast extract），0.2%的蛋白胨（Tryptone），0.05%的MeSO4·7H2O，0.46%的KH2PO4。

CYM培养基（固体）：1%的麦芽糖，2%的葡萄糖，0.2%的酵母提取物（Yeast extract），0.2%的蛋白胨（Tryptone），0.05%的MeSO4·7H2O，0.46%的KH2PO4，1%的琼脂粉。

1.1.3试剂与溶液

试剂：冰醋酸、95%乙醇、100%乙醇、香兰素、高氯酸、茉莉酸甲酯（MeJA）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、维生素C(Vc)、抗坏血酸（CAT）、ROS染料等。

溶液：香草醛：将5 g香兰素溶解于100 mL冰醋酸。

1.1.4主要仪器设备

分析天平、种子破碎机、摇床、高压蒸汽灭菌锅、分光光度计、荧光显微镜、超声波清洗仪、研钵、恒温水浴锅、烘箱、超净工作台等。

1.2实验方法

1.2.1菌种的活化和接种

（1）培养基的配置：按照已知的培养基配方分别配制PDA固体和液体培养基、CYM固体和液体培养基，标记后均需要在高压灭菌锅中进行灭菌处理，温度为121 ℃。

（2）菌种活化：将保种管中保存的菌种，无菌操作接种到PDA固体培养基中，倒置于28 ℃培养箱中活化培养至菌丝接近长满平板（一般活化时间需要7-12 天不等，根据不同菌种的休眠状态不同所需要的活化时间会有所差别）。

（3）平板培养：将活化好的灵芝菌丝接种于PDA培养基中，28 ℃培养箱倒置培养。培养7 天，菌丝基本布满平板，可留作后续发酵实验菌种；培养3-5 天，菌丝大约长至平板半径一般位置，可进行插片处理，继续培养2-3 天待菌丝爬上盖玻片，可用作观察计算ROS的含量。

（4）发酵培养：将平板中培养的菌种，无菌操作接种于装有100 mLPDA液体培养基的250 mL锥形瓶中，放置在28 ℃，150 r/min摇床中摇种培养5 天。使用种子破碎器将摇好的灵芝菌种打碎，并吸取一定量打碎的菌种接于PDA液体培养基中，放置28 ℃摇床发酵培养7 天。

1.2.2测定野生型和转化子中ROS的含量

（1）进行平板实验：在PDA固体培养基中接种野生型（WT）、对照1（CK1）、对照2（CK2）、沉默转化子（30684i-5）、沉默转化子（30684i-7）培养 3-4 天后，在合适的位置进行插片，然后继续在28 ℃培养箱中培养。

（2）荧光显微镜观察：待菌丝长至载玻片上后，目测涨势薄厚适当的盖玻片进行处理观察；用酒精棉球擦除较厚的多余菌丝，有时盖玻片两面都有菌丝爬上，擦除一面；在载玻片上滴加10 μLROS染料，将有菌丝一面载玻片浸染在染料中，染色20 min；另取载玻片，并在载玻片上滴加一滴水；轻轻揭下菌丝染色的盖玻片，将有菌丝一面向上放置于水滴上，晾干（20 min左右）；然后使用荧光显微镜观察并拍照，对所拍照片进行数据处理，最后计算ROS含量的变化。 灵芝bHLH型转录因子GL30684对灵芝酸生物合成的调控研究(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206475.html