2 中叶位

3 下叶位

11 涂抹上叶位，采摘上叶位

12 涂抹上叶位，采摘中叶位

13 涂抹上叶位，采摘下叶位

21 涂抹中叶位，采摘上叶位

22 涂抹中叶位，采摘中叶位

23 涂抹中叶位，采摘下叶位

31 涂抹下叶位，采摘上叶位

32 涂抹下叶位，采摘中叶位

33 涂抹下叶位，采摘下叶位

1．2．4 植物分子实验操作方法

1．2．4．1 烟草组织总RNA的提取与引物设计 取烟草叶片100 mg液氮研磨用TAKARA MiniBEST Plant RNA提取试剂盒总烟草RNA。提取后获得的RNA经超微量分光光度计（One DropTM，OD-1000+Sepctrophotometer）测定浓度。根据烟草TPK1基因（EU161633.1）和actin基因（X63603.1）按照标准荧光定量PCR引物设计原理用Primer Primer5.0软件设计特异性引物。烟草TPK1基因上游引物确定为：ATGGAGAAAGAGCCTCTTCTC，烟草TPK1基因下游引物确定为：TTAATGGTGGTGGCTTTCCAT，actin基因上游引物为：GGTAGCTCCACCTGAGAGGAAGT，actin基因下游引物确定为：GCCTTTGCAATCCACATCTGT。

1．2．4．2 cDNA的合成 使用TAKARA PrimeScript™ RT试剂盒进行反转录、合成cDNA作为后续荧光定量模板，最终体系为20ul，-20℃冰箱保存备用。

1．2．4．3 定量PCR 使用TAKARA SYBR® Premix Ex Taq™荧光定量试剂盒分别用烟草actin、TPK1引物进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，确定后续荧光定量模板浓度范围。以actin作为内参，测定TPK1在烟草不同处理条件下的表达量。

1．2．4．4 标准曲线的制定 在样品扩增的同时，可以试验不同处理的cDNA模板混合样进行系列梯度稀释制作标准曲线。研究表明，Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数越小。本试验以5倍浓度梯度稀释，同时以TPK1和actin为特异引物进行扩增来获得标准曲线，纵坐标为临界循环值Ct，横坐标为稀释浓度的以5对底数的对数值。

1．3 测量方法

1．3．1．原子吸收分光光度计测量单位重量叶片中K离子含量 烟草样品分别放于不同的纸袋，80℃烘干3天后称量干重，并放入洗净的消煮管。称量6份0.2g标准样品放入消煮管。消煮管中加入消煮液 (硝酸：高氯酸=87：:13) 5ml，浸泡样品过夜，进行冷消煮。同时，在6支空消煮管中加入5ml消煮液。消煮过程如下：85℃ 30min，100℃ 30min，110℃ 45min，120℃ 60min，140℃ 60min，160℃ 70min，180℃持续至溶液无色透明，并煮干。加入10ml 2.5%硝酸60℃水浴加热回溶30min，静置过夜。转移至10ml离心管。使用AnalytikJena novAA400P原子吸收光谱仪通过火焰法(AAS)测量稀释液中钾元素含量。

1．3．2．实时荧光定量PCR的计算方法 根据标准曲线所得的线性计算公式，将样品的Ct值代入公式，得到其相对浓度。同一个模板中的目的基因和看家基因的相对浓度的比值即可作为目的基因相对表达水平。

缺钾胁迫下烟草不同叶位间钾离子的吸收与转运(4):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206473.html