1. 实验材料与方法

1.1 蝉花的采集与预处理

本实验以浙江新昌地区的野生蝉花为实验对象，将采集来的蝉花表面的泥土洗净，分别通过升汞、75%的乙醇除去其表面的其他细菌。将其烘干至恒重后用研磨机磨碎至200目。

1.2 蝉花的有效抑菌物质提取

将蝉花粉末分别使用水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等溶剂，选取适宜的提取时间、料液比、提取温度和提取次数 (表1)等工艺参数对蝉花活性物质进行粗提取。其中，用丙酮提取时，分别离心收集24、48和72 h的浸提液，并且合并滤液。用旋转蒸发仪将提取液浓缩至膏状或蒸干，再使用纯净水溶解至相应同一浓度，保存于4 ℃备用。

表1.蝉花活性物质提取条件

提取试剂 提取温度 料液比 提取时间h

水 100 1：25 1

95%乙醇 80 1：25 1

甲醇 60 1：30 3

丙酮 25 1：10 72

乙酸乙酯 70 1：25 3

1.3 蝉花抑菌活性研究

1.3.1   抑菌谱研究   

    分别以大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi）、白色念珠菌（Candida albicans）、链格孢菌（Alternaria alternata）、扩展青霉（Penicillium extenditur）和黑曲霉（Aspergillus niger）为指示菌，采用牛津杯法测定蝉花提取物抑菌活性。取对数期的菌液按照2.0 %的接种量制备指示菌平板，将牛津杯水平均匀地放置平板上，实验组加入200 L不同蝉花提取液，4℃静置2h后37℃过夜培养，测量抑菌圈直径，建立不同蝉花提取物的抑菌图谱。

1.3.2   蝉花醇提物抑菌稳定性研究

1.3.2.1 蝉花醇提液对温度的耐受性

取1.0 mL蝉花醇提液分别在不同温度(40，80，100和121℃)下处理30 min。此外，为探究提取液低温存储稳定性，将1.0 mL蝉花醇提液分别置于-20 ℃和4下保存24 h，48h，7d和15d。以铜绿假单孢菌为指示菌，牛津杯法测定不同温度处理后蝉花醇提液的抑菌活性，实验组加入200µL处理过的样品，以未经处理的样品作为对照，观察抑菌活性，实验重复3次。

1.3.2.2 蝉花醇提液对pH的耐受性

取10 mL蝉花醇提液，用0.5mol/L盐酸溶液或0.5mol/L氢氧化钠溶液将pH分别调至2，4，6, 8, 10于25 ℃处理3 h后，pH调至6.8。分别以铜绿假单孢菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌和化脓链球菌为指示菌，牛津杯法测定处理后蝉花醇提液的抑菌活性，实验组加入200 µL处理过的样品，以未经处理的样品作为对照，观察抑菌活性，实验重复3次。 蝉花醇提物抑菌活性及稳定性研究(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206024.html