图2- 1 DHAV-1 VP1基因多序列比对结果

表格 3上、下游引物与探针序列及其结合为点

名称 序列(5’-3’)及标记的基团 结合位点 靶基因

DHAV-1F TATCQCQGTACCATTCQACQCQG 363-385 VP1

DHAV-1R CQGAAAGGCQTCCQGATTG 485-502

DHAV-1P FAM–ACACCACQCAGGCCAACQCGACCAAT - BHQ-1 388-413

2.1.2引物特异性初检

为初步检验所设计引物的特异性，以所购买的DHAV-1 A66弱毒疫苗为模板进行实时荧光定量RT-PCR检测，SYBR Green作为唯一荧光信号源，初步检测引物特异性。

2.2标准阳性质粒构建

2.2.1病毒RNA提取

1) 在2000μL EP管中加入300μL A66弱毒疫苗，后加入1000μL Trizol试剂，轻轻吹打混匀后在室温下静置5min。

2) 向溶液中加入200μL氯仿，涡旋振荡15s混匀，在室温下静置2min。

3) 在4℃条件下，以12000rpm的转速离心15min。

4) 吸取上清将其转移到另一2000μL EP管中，加入500μL异丙醇，轻轻吹打混匀管中液体，然后在室温下静置10min。

5) 在4℃条件下，以12000rpm的转速离心15min。

6) 弃去全部上清液，加入1000μL 75%乙醇（DEPC H2O配制）轻轻洗涤沉淀物。在4℃条件下，以7500rpm的转速离心5min。

7) 弃去全部上清，开盖晾干。待残余酒精完全挥发后加入20μL DEPC H2O，放置于65℃水浴锅内水浴5min后，迅速放至冰上冷却，保存于-20℃以备后用。

2.2.2病毒RNA反转录

按表格4中各试剂用量配制20μL反应体系，吹打混匀，稍微离心除去气泡。置于42℃水浴锅内水浴60min，后移至70℃的水浴锅内孵化5min来终止体系内的反应，待RNA反转录完成后，将产物（cDNA）放置于-20℃保存以备后用。

表格 4病毒RNA反转录所需试剂名称及用量

试剂 体积（μL） 终浓度（/μL）

RevertAid Reverse Transcriptase 1 10u

RiboLock RNase Inhibitor 1 1u

dNTP Mix 2 10-3μmol

随机六聚体引物 1 0.5×10-5μmol

5x Reacqion Buffer 4 ——

DEPC H2O 9 ——

RNA提取物 2 ——

2.2.3目的片段扩增

用PCR小管按表格5中各试剂用量配制50μL反应体系，吹打混匀管内液体，稍微离心除去气泡，放入PCR仪中。95℃预变性5min；95℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸15s。进行共计约35个反应循环，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的最终产物。

表格 5普通PCR反应所需试剂名称及用量 Ⅰ型1系鸭肝炎病毒（DHAV-1）实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立(3):http://www.chuibin.com/yixue/lunwen_206218.html