1．2 方法

1.2.1 构建植物双源表达载体

将来自于Sphingobium sp. strain YBL2的N-脱甲基酶基因pdmA及pdmB的氨基酸序列，通过南京金斯瑞生物科技有限公司Genscript’s Optimum GeneTM 密码子优化系统优化，再由该公司合成ATCTP（拟南芥叶绿体转运肽）和pdmA核苷酸序列及ATCTP和pdmB核苷酸序列，合成的ATCTP和pdmA核苷酸序列的5’端及3’端连接有SnaBI酶切位点，合成的ATCTP和pdmB核苷酸序列的5’端及3’端连接有KasI酶切位点。将合成的ATCTP和pdmA核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN01-T1。同样的方法，将合成的ATCTP和pdmB核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，得到重组克隆载体DBN01-T2。用限制性内切酶SnaBI单酶切重组克隆载体DBN01-T1和表达载体DBNBC-02，将切下的核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-02的SnaBI位点之间，构建成重组表达中间载体DBN10938M，用限制性内切酶KasI单酶切重组克隆载体DBN01-T2和中间载体DBN10938M，将切下的核苷酸序列片段插到中间表达载体DBN10938M的KasI位点之间，构建成重组表达载体DBN10938。

1.2.2筛选转基因纯合子植株

对己经构建正确的重组表达载体DBN10938用液氮法转化到农杆菌GV3101中，然后通过农杆菌介导的的拟南芥花序浸染法，将目的基因pdmAB整合到哥伦比亚型拟南芥中。收获的T1代种子点种在含8 mg/L的草铵膦1/2 MS4固体培养基中筛选。T2代和T3代的种子依据同样的方法进行筛选，最后依据孟德尔的遗传定律筛选得到抗性较好的三种转基因纯合子，命名为T3-2、T3-3、T3-4。

1.2.3 转基因拟南芥的抗性能力研究

为了研究转pdmAB拟南芥的抗性情况，将种子用6%的次氯酸钠消毒15分钟，再用无菌水反复清洗6次，然后点种在含30 mL 1/2 MS固体培养基（含1.5%蔗糖，1%琼脂糖，pH 5.8）的平板上，培养基里加有0 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、15 mg/L 异丙隆中。在4℃，光条件下同步化2天后，将拟南芥平板垂直放置在23-20℃，16h光照/8h黑暗的光照培养箱中生长，30d后测量拟南芥根长、鲜重、叶片表面积大小。

1.2.4 异丙隆对拟南芥光合作用影响研究

为了研究异丙隆对植物光合作用的影响，将培养基中15d大拟南芥幼苗移植于合成土壤中（121℃灭菌30min），合成土壤含营养土和蛭石，比例为1:3，pH7.2±0.2。30d后按照异丙隆田间喷药剂量 (1.05-1.2 kg/ha IPU 溶解在750-900 kg/ha 水中), 取0.09 g IPU 溶解于 33 g 水，喷洒于40个花盆总共160颗拟南芥苗中 (20天大)。 7d后取3-5片叶，利用紫外分光光度计测量470、649及 665 nm的吸光度并计算拟南芥中叶绿素含量。

1.2.5 IPU及其代谢产物在培养基内的含量研究

为了研究植物根、叶中IPU及代谢产物的含量，拟南芥根和叶表面用去离子水清先3次，再用20% 甲醇清洗3次去除表面附着的IPU及产物，液氮研磨后，叶样品利用PSA/GCB/C18纯化柱纯化去除叶绿素,提取叶中药含量。根样品用1% 的乙酸乙腈直接萃取萃取，待乙酸乙腈挥发后，加100μL甲醇溶解，通过高效液相检测根、叶中IPU及产物的量。所有实验均设有三个重复，野生型和转空载体拟南芥作为对照。 转pdmAB基因拟南芥修复土壤中取代脲类除草剂的研究(4):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206476.html