2.2.1 不同条件下T7核酸外切酶活性及外切速度比较

2.2.1.1 不同温度和时间下T7核酸外切酶活性及外切速度比较

（1）反应体系：2 μl 标记DNA（~250ng/μl）, 0.7 μl 10 Taq DNA ligase buffer, 0.1 μl T7核酸外切酶(10U/μl)，加双蒸水至7μL

（2）反应条件：将上述反应体系分别在45℃、50℃水浴10min、20min、60min、90min。

（3）每次在冰中加入2 μl EDTA 终止反应，然后加入2 μl loading buffer，并进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析

2.2.1.2 不同的T7核酸外切酶活力下外切速度比较

（1）反应体系：1 μl 10 T4 DNA ligase buffer，1 μl dNTPs，5 μl vector DNA，1 μl insert DNA，0.3 μl T4 DNA聚合酶（5U/μl），0.5μl T4 DNA聚合酶（3U/μl）；再分别加入1μl 、0.5μl 、0.25μl 的0.05 U/μl T7核酸外切酶，使得T7核酸外切酶的活性分别为0.05U、0.025U、0.0125U；最后加双蒸水至10μl体系。

（2）反应条件：将上述反应体系置于45℃水浴锅中水浴30min。

（3）分别取5 μl连接产物，加入置于冰上的50 μl感受态细菌（在1.5 ml管）中，放置在冰上30分钟，42℃热休克1分钟，置冰上2分钟，加入0.5ml 未加氨苄青霉素的LB液体，在37℃于200rpm的摇床中复苏30分钟。

（4）分别取混匀的250 μl细菌悬液涂于加氨苄青霉素的 LB培养基，并编号，37℃培养过夜（14-16小时），观察细菌菌落并计数。