重叠PCR是在PCR技术发明不久后发现的，无论重组位点上的核苷酸序列如何，都不需要使用限制性内切酶或连接酶，可在精确的连接处重新组合DNA分子。一般无合适的可用于PCR扩增的模板DNA时，或者需重组基因相对较短（<500bp）时，则可方便使用此方法。[7] LIC是一种不依赖于限制性内切酶和连接酶的克隆方法。该方法是使用具有3’  5’ 核酸外切酶活性（T4或Pfu聚合酶）的DNA聚合酶产生12bp 具5’突出端的DNA片段以进行退火。使用含有核糖核苷酸的嵌合PCR引物，通过用其他试剂如尿嘧啶DNA糖基化酶[11]或稀土金属离子[12]处理PCR产物，也可以产生具有粘性突出端的LIC末端。由于其简单性，该方法可用于促进高通量克隆实验。In-FusionTM PCR克隆体系（www.bdbiosciences.com）允许将PCR片段克隆到任何线性化载体中，只要PCR片段含有与载体片段中同源的序列。[13]然而该反应中涉及的酶的确切组分未被公司披露。由于末端对于该反应至关重要，因此需要专门准备载体片段以实现插入片段与载体中现有的ORF的无缝融合。可以使用反向PCR或通过用IIS型限制性内切酶处理以去除不需要的核苷酸来制备载体片段。[14] 

Daniel G Gibson等人[15]研究了两步热循环法，之后经过改进又提出了一步等温组装法，这种方法可用于连接大至583 kb的DNA分子，并可在大肠杆菌中克隆多达300 kb的连接产物，大大简化了大DNA分子的构建。CAME ( Complementary annealing mediated by exonuclease )技术[16]，即由外切核酸酶介导的互补退火，其中插入片段或载体片段被扩增以携带与另一个互补的序列，并且两个片段都被外切酶修饰以产生定向的单链突出端。两个凹入的DNA片段通过互补链退火连接。该技术能克隆至少12 kb的DNA片段，几乎能克隆到载体的任何位置，而且有能力从DNA混合物中克隆单个DNA片段。此外，利用CAME的凹陷和退火性能，CAME的应用大大提高了定点诱变的效率。

1.4 本研究的内容及意义

目前的无缝克隆技术主要是双链DNA分子克隆，而且多需要先经过PCR扩增再与载体连接。并且经过不断的技术改进，实现了大分子DNA片段的克隆和多片段DNA无缝连接。但是对于单引物克隆以及不经PCR扩增的外源基因克隆少有研究。目前有NEBuilder®高保真DNA装配克隆试剂盒（www.neb.com），该试剂盒允许多个DNA片段的无缝组装，而不管片段长度或末端兼容性如何，并且已用于装配单链寡核苷酸或不同大小的DNA片段（15-80bp）。该方法操作简单快捷，适用于多种DNA操作，包括定点诱变。但是关于该反应中涉及的酶的确切组分未被公司披露。因此我们试图找寻出最合适的酶和反应条件，以实现把不需经过PCR扩增的外源基因片段克隆到目的载体中，并实现多片段单链寡核苷酸无缝克隆。

本研究主要是联合使用 T7外切核酸酶，Pfu或KOD等DNA聚合酶以及Taq DNA连接酶以实现单引物克隆，并实现不需要经过PCR扩增的外源基因克隆，进一步简化无缝克隆技术操作。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

实验研究所用的主要材料和试剂有：大肠杆菌DH5α ，质粒pBluescript Ⅱ SK(+)、pBluescript Ⅱ KS(-)、λ DNA，限制性内切酶EcoR Ⅰ 、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ、EcoR Ⅴ，T7核酸外切酶，KOD DNA 聚合酶，T4 DNA 聚合酶, T4 DNA连接酶，Taq DNA连接酶，凝胶回收试剂盒，LB培养基，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），琼脂糖，双蒸水等。

实验研究所用的主要仪器有：恒温水浴锅、恒温培养箱、通风橱、离心机、移液器、PCR仪、电泳槽、摇床、微波炉等。

2.2 实验方法 引物桥接克隆方法研究(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206335.html