1.2.5、发根农杆菌K599对不同温度的适应性

配制LB固体培养基平板（配制方法同上）。在洁净的超净台内，用移液器吸取发根农杆菌K599细菌悬液100L滴在平板上，再用灼烧后冷却的涂布棒进行涂布处理。分别倒置于8℃，18℃，28℃，38℃，48℃的恒温培养箱内进行过夜培养，每个温度做三个平行实验，观察并记录野生型发根农杆菌K599在不同温度情况下的生长情况。

1.2.6、设计ITS序列引物

实验用的是扩增细菌16S rDNA的通用引物。即常用的一对引物27F和1492R，基因序列为27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。经查阅资料，扩增出的基因片段大约1500bp左右。

1.2.7、发根农杆菌K599质粒DNA的提取

实验按照AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒内的说明步骤进行提取。

A:用2 ml离心管收集1.0×109（1 ml菌液OD600为1-1.5）的农杆菌K599培养物，12,000×g离心30s，弃尽上清。用150 μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀。

B :加入20 μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5 min。

C:加入30 μl 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5 min。

D:加入450 μl Buffer G-A,旋涡振荡15 s，65℃水浴10 min。

E:加入400 μl Buffer G-B和1 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合，12,000×g离心2min。

F:尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合， 12,000×g离心2 min。

G:丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2 ml离心管中）。12,000×g离心1 min。

H:弃滤器，在滤液中加入400 μl Buffer BV，混合均匀。

I:将制备管置于2 ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。

J:弃滤液，将制备管置回到原2 ml离心管中，加入500 μl Buffer W1，12,000×g离心1min。

K:弃滤液，将制备管置回到原2 ml离心管中，加入700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min。

L:以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。

M: 弃滤液，将制备管置回到原2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。

N:将制备管置于另一洁净的1.5 ml离心管中，在silica膜中央加100-200 μl Eluent 或去离子水，室温静置1 min。12,000×g离心1 min洗脱DNA。

经以上实验步骤即可提取到野生型发根农杆菌K599的质粒DNA。

1.2.8、PCR扩增K599的ITS特征序列

将PCR实验要用的DNA模板、引物、缓冲液、酶、dNTP、ddH2O等试剂都置于冰上，使扩增效果好。然后用移液器在0.2ml离心管中加入以下成分：

DNA（20ng/l） 1.0l

10×Buffer(含2.5mM Mg2+) 5.0l

Taq 聚合酶(5/μL) 1.0l

dNTP（10mM）） 1.0l

27F 引物 (10M) 1.5l

1492R 引物 (10M) 1.5l

ddH2O 39.0l

总体积 50.0l

然后轻弹并混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应。PCR仪的设置参数如下：

预变性 变性 退火 延伸 终延伸 循环数

95℃，5min 95℃，30s 58℃，30s 72℃，1min30s 发根农杆菌K599形态生理特征和分子分类分析(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206186.html