根据Ri质粒转化植物后产生的毛状根合成冠瘿碱（opine）的类型不同，将Ri质粒分为4种类型：农杆碱型（agropine type）、甘露碱型（mannopine type）、黄瓜碱型（cucumopine type）和异黄瓜碱型（mikimopine type）[3]。其中发根农杆菌K599是黄瓜碱型的典型代表菌株。现有大量研究报道表明，K599对多种植物均具有较高的侵染性，如菊花[4]和黄瓜[5]，特别是K599能高效介导豆科作物的转基因[6]，克服了豆科作物研究的瓶颈，大大促进了豆科植物根部功能基因的研究进展。虽然发根农杆菌K599在介导植物转基因方面已经体现出大量的应用价值，但是发根农杆菌K599的形态生理特征和分子分类分析尚未完善。因此，本研究对发根农杆菌K599进行了镜检观察，定性实验和基因检测分类，以期更加完善发根农杆菌K599的形态生理特征和分子分类分析。
1、材料与方法
1.1、材料及仪器
野生型发根农杆菌K599；共聚焦激光扫描显微镜；AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒恒温培养箱；PCR仪：Applied Biosystems 2720 Thermal cycler；离心机：Eppendorf 5804R；凝胶成像系统：Tanon 2500，天能公司。
1.2、实验方法
1.2.1、发根农杆菌K599的预处理
在洁净的超净台内，用灼烧后冷却的接种针将于-80℃甘油保藏的野生型发根农杆菌K599菌种在LB固体培养基平板上进行划线（LB固体培养基的配制方法为：在1 L培养基中，加入去离子水950 ml，胰蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，氯化钠（NaCl）10 g，琼脂粉15 g，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，再用去离子水定容至1L，最后121℃高压蒸汽灭菌20 min）。然后倒置在28℃恒温培养箱内，培养过夜。从平板上选取生长较好的单个菌落，并在洁净的超净台内，用灼烧后冷却的接种针将单菌落接种到在20 ml的LB液体培养基（配制方法同上，但不加琼脂）中，放置于28℃且转速为230~250 r/min的摇床上，过夜培养，使其恢复活力且旺盛生长。经预处理后，可对发根农杆菌K599进行进一步的实验分析。
1.2.2、显微镜观察发根农杆菌K599细胞形态
于洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用移液器吸取发根农杆菌K599细菌悬液20L加入蒸馏水中（根据液体培养基浓度调整比例），并混匀，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，即临时装片制作完成。正确规范操作使用共聚焦激光扫描显微镜，观察野生型发根农杆菌K599的形状、大小、运动性等特征，认真做好记录并拍摄照片。
1.2.3、发根农杆菌K599对不同抗生素的抗性
分别配制LB+Str（链霉素）50mg/L的固体培养基，LB+Kan（卡那霉素）50mg/L的固体培养基，LB+Cef（头孢霉素）50mg/L的固体培养基（配制方法同上，但是趁热倒平板前分别加入不同的抗生素并混合均匀）。对照组培养基不加抗生素。在洁净的超净台内，用移液器吸取发根农杆菌K599细菌悬液100L滴在平板上，再用灼烧后冷却的涂布棒进行涂布处理。每种抗生素做三个平行实验，对照也三个平行实验。然后倒置在28℃恒温培养箱内，培养过夜。观察并记录野生型发根农杆菌K599在不同抗生素情况下的生长情况。
1.2.4、发根农杆菌K599对不同盐（NaCl）浓度的耐受性
分别配制含盐（NaCl）浓度为0，0.5%，1%，2%，4%，6%，8%，10%的LB固体培养基平板（配制方法同上，但是加入的NaCl的量不同）。在洁净的超净台内，用移液器吸取发根农杆菌K599细菌悬液100L滴在平板上，再用灼烧后冷却的涂布棒进行涂布处理。每个盐浓度做三个平行实验，然后倒置在28℃恒温培养箱内，培养过夜。观察并记录野生型发根农杆菌K599在不同盐（NaCl）浓度情况下的生长情况。 发根农杆菌K599形态生理特征和分子分类分析(2):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206186.html