1．2．2  载体构建   

选取TaRLK3-3B保守区段设计扩增片段引物VIGS_1_F1、VIGS_1_R1以TOPO-TaRLK3-3B质粒为模板进行高保真的扩增，采用酶切连接方法将胶回收产物与酶切完全的BSMV:γ载体进行连接，酶切位点为Nhe I，最终筛选反向正确插入片段的连接载体，获得BSMV:TaRLK3-3B。

1．2．3  反向插入克隆的筛选

挑选单克隆摇菌，利用菌液PCR反应筛选有插入子的阳性克隆。先用第1步设计的左右引物扩增，扩增出有目标片段单克隆说明是插入了目标片段的。然后用载体上的γ-strain-p引物（序列组成为5´-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3´，γ引物距离Nhe Ⅰ酶切位点约230bp）与第一步设计的正、反向扩增引物分别组合，筛选外源片段反向插入到载体Nhe Ⅰ酶切位点的重组质粒。   

1．2．4  载体的线性化   

BSMV:TaRLK3-3B、α、BSMV:PDS和BSMV: γ空病毒载体质粒用限制性内切酶MluI，β用限制性内切酶SpeI分别进行线性化酶切。

1．2．5  体外转录反应   

对酶切产物用PCR cleanup试剂盒的柱子纯化回收，最后用DEPC水溶解。

(1) 参照Promega公司RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 & T7 Kit说明书，对纯化的线性化产物进行体外转录；

(2) 37℃转录6 h，取 0.2 μl上述体外转录产物加适量loading buffer，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以而确保足够的病毒量侵染小麦穗部。转录产物可临时置于-70℃冰箱保存备用，但时间不要太长，避免RNA降解。

1．2．6  接种病毒   

病毒接种：取15μl α、β病毒载体体外转录产物分别与BSMV:γ空病毒载体、BSMV:PDS病毒载体、BSMV:TaRLK3-3B体外转录产物等体积混合后再加上一倍体积的 2×GKP Buffer缓冲液的混合液，将混合物接种在刚刚舒展开的幼苗第二叶叶片上。

接种BSMV:PDS 植株，用于表型鉴定，当整个穗子包括旗叶有发白表型，表明VIGS体系成功。接种 BSMV:TaRLK3-3B的植株，用于目的基因沉默。同时设置接种BSMV:γ的植株作为对照（MOCK）。每个基因每次重复接种处理15个穗子，进行三次生物学重复。接种后喷少许RNAase free水，将接种后的植株22℃黑暗保湿24 h，之后在14 h/10 h光/暗周期，24℃左右的条件下培养，定期观察PDS漂白以及病毒的褪绿症状。

1．2．7  目的基因沉默效率分析   

在接种赤霉菌后96 h，对MOCK、BSMV:PDS、BSMV:TaRLK3-3B植株的赤霉菌接种点取样，提取RNA，利用Q-TaRLK3-F1/Q-TaRLK3-R1引物进行目的基因表达分析，检测基因沉默效率。

1．2．8  赤霉病鉴定   

接种大麦条花叶病毒后约9d左右，待植株长至扬花期，用单花滴注接种法接种赤霉菌株Fg0609，每个穗子接种2朵小花，喷雾套袋保湿3d，保证诱导充分，在苏麦3号中沉默TaRLK3-3B，接种后8 d、9 d、11 d进行三次赤霉病表型调查；在望水白中沉默TaRLK3-3B，接种后5 d、7 d、9 d进行三次赤霉病表型调查。

2  结果与分析 

2．1  载体构建

选取TaRLK3-3B保守区段设计扩增片段引物VIGS_1_F1、VIGS_1_R1 ，以TOPO-TaRLK3-3B质粒为模板进行高保真的扩增224bp片段作为外源插入片段（图1A）。采用酶切连接方法将胶回收产物与酶切完全的BSMV:γ载体进行连接，经菌液PCR（图1B）和酶切验证（图1C）并最终通过测序方法筛选反向正确插入片段的连接载体，获得BSMV:TaRLK3-3B。