1.3研究的目的和意义

作为浙江省重要的特色道地性中药材，温郁金具有极大的开发潜力。目前，国内外学者对温郁金的研究主要集中在化学成分分析、药理学作用、不同部位微量元素测定[25-29]等方面，而有关温郁金叶绿体全基因组分析、种质资源鉴定、遗传多样性、系统发育的研究极少，且关于温郁金叶绿体全基因组分析的研究尚且处于初级阶段，没有有效的资源可以利用而这些研究将会直接或间接的影响到对温郁金的种质资源的鉴定、保育和利用。

本研究拟以温郁金为研究对象，开展对温郁金叶绿体基因组测序、拼接及注释、重复序列鉴定、比较基因组学分析等研究工作。本课题的开展将为温郁金的种质资源鉴定、系统发育研究及保护提供可靠的参考数据，为实现最大限度的保存温郁金种质多样性和遗传多样性，为进一步开发利用温郁金种质资源提供更为广阔的信息平台。

2材料与方法

2.1实验材料、试剂及仪器

2.1.1实验材料

供试材料是健康的温郁金活体样品。样品采自浙江省金华市磐安县。

2.1.2试剂及实验仪器

试剂：2 ×CTAB缓冲液，氯仿/异戊醇（24：1）液氮，70%乙醇，异丙醇，1 ×TAE缓冲液，6 ×DNA凝胶上样缓冲液，琼脂糖，100 mg/ml溴化乙锭（EB），标准分子量DNA，液氮，Mg2+，dNTPs，Taq聚合酶，cpSSR引物等

实验仪器：研钵，保存箱，离心机，微量紫外分光光度计，琼脂糖凝胶电泳系统装置，PCR仪，电热恒温水浴锅，加热磁力搅拌器，微量移液器，电子天平，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统等。

2.2实验方法

 2.2.1温郁金总DNA提取及质量检测

2.2.1.1温郁金总DNA 提取

（1）用灭菌处理的干净剪刀剪取2 cm左右新鲜温郁金叶片，并将其置于研钵中，加入适量液氮，用力研磨至粉末状后，将粉末状温郁金叶片全部转移至1.5 mL的离心管中。

（2）2 ×CTAB缓冲液于65 ℃条件下提前预热，用移液枪吸取已预热的2 ×CTAB缓冲液600 μL加入到离心管中，缓慢震荡离心管30 s使其充分混合均匀，然后将离心管放入65 ℃的水浴锅中加热40 min。

（3）从65 ℃水浴锅中取出将离心管后，用移液枪吸取等体积氯仿/异戊醇加入到离心管中，缓慢轻轻震荡离心管使其充分混合均匀，充分反应完全后，室温下10000 rpm离心10 min。

（4）移液枪吸取500 μL上清液于新的洁净的经消毒灭菌处理的离心管中，然后加入2/3体积的异戊醇，缓慢轻轻颠倒离心管，使离心管内液体充分混合均匀，DNA呈肉眼可见的絮状沉淀，然后将离心管置于-20 ℃的条件下1 h。

（5）1 h后将离心管取出并将其置于离心机上，在12000 rpm的条件下离心10 min，然后去除上清，接着用移液枪吸取200 μL 70%乙醇加入到离心管中进行洗涤操作。

（6）将进行洗涤操作后的离心管置于离心机上，然后在12000 rpm的条件下离心5 min去除残余的乙醇，接着风干处理。

（7）移液枪吸取30 μL TE或者双蒸水于离心管中，充分溶解上述操作中提取到的DNA，然后用移液枪吸取5 μL 充分溶解的DNA进行电泳，剩余样品DNA置于-20 ℃的条件下保存备用。