表5-3 em2荧光强度峰值与激发光波长的关系 9

表5-4 em2峰值荧光强度随时间的变化 11

1 引言

大肠杆菌是人和动物肠道里一种最常见的菌种，它侵入人体的一些部位时会引起感染，如腹膜炎、膀胱炎、胆囊炎以及腹泻等。大肠杆菌主要通过水和食物进入人体，因此，大肠杆菌菌群常被作为饮水和食品的卫生学标准。传统检测大肠杆菌的方法是用乳糖胆盐发酵管观察，检测过程漫长，至少需要24小时。利用荧光光谱可以为我们提供一种高效、快速、低成本的检测大肠杆菌的方法。国外有一些学者已经就此课题开展研究，德国的Stephan Determann等研究了海水中菌类的荧光激发、发射光谱与菌的浓度的关系；美国的R.C.Chin等对水中、空气中传播的致病菌的荧光光谱作了研究,开发出可以对这些菌进行鉴别以及检测其荧光寿命的仪器。国内也有一些学者也对光与微生物作用开展了研究，江南大学的武浩等对一系列益生菌的吸收和荧光光谱进行了研究。本文主要研究大肠杆菌在不同激发光波长下的发射光谱和不同浓度下的发射光谱以及在不同培养时间下的发射光谱。使用荧光光谱仪来检测不同培养时间大肠杆菌的荧光光谱，对研究大肠杆菌种群的生长规律有着重要的意义；研究不同激发光波长下大肠杆菌的发射光谱，可以找到大肠杆菌的最佳激发光；研究不同浓度下大肠杆菌的发射光谱有助于分析大肠杆菌的组成成分。

2 实验原理

根据Boltzmann分布,分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸收了紫外-可见光后,基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的各个不同振动-转动能级,根据自旋禁阻选律,不能直接跃迁到激发三重态的各个振动-转动能级。处于激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多余的能量而返回基态。分子产生荧光必须具备的条件是具有合适的结构和一定的荧光量子产率。

微生物里有机物的结构对荧光的产生有影响,其中包括共轭效应、刚性平面结构、跃迁类型、取代基效应等方面。影响荧光强度的外部因素包括温度、溶剂、溶液pH、溶液荧光的猝灭、内滤光作用和自吸现象等。

3 菌种介绍

大肠杆菌又被称为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），是Escherichia在1885年发现的，属于原核生物。大小0.5～1.5微米，周生鞭毛，无芽孢，能运动。具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体等简单的细胞器，没有细胞核只有拟核，其细胞质中的质粒常被用作基因工程中的运载体。能发酵多种糖类产气、产酸，是人和动物肠道中的正常栖居菌，代谢类型是异养兼性厌氧型。婴儿出生后即随哺乳进入肠道，伴随着人的一生，约占粪便干重的1/3。根据国家规定，每毫升饮用水中的大肠杆菌菌落总数小于100，每100毫升水中不得检出总大肠菌群。

4  实验部分

4.1实验试剂、样品及装置

实验所用的菌种为大肠埃希氏菌菌种。试剂为LB液体培养基（胰蛋白胨50%、酵母粉25%、氯化钠25%）、生理盐水、无水乙醇、蒸馏水。装置为稳态/瞬态荧光光谱仪（FLS 920）、除菌箱、酒精灯。

4.2稳态/瞬态荧光光谱仪的开机步骤

1）打开总电源（开之前要保证光谱仪所有仪器开关关闭）。