1.2.1.3  MS培养基的配置

（1）按照配方（MS：2.215g/L，蔗糖：10g/L，琼脂：8g/L，PH=5.7-5.8）配置固体培养基，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃，15分钟）。

（2）超净工作台使用前喷75%杀菌消毒，将实验所需培养基、无菌枪头等放在超净台中，紫外灯灭菌20分钟。

（3）关闭紫外灯后，将灭过菌的培养基在超净台中打开，分别倒入各培养皿中。待培养基完全凝固后，用封口膜包裹封存，标明配置时间，4℃下保存。

1.2.1.4  幼苗的移栽及培养

1.2.1.4.1  移土

（1）将营养土与蛭石按1：1混合均匀后，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌后均匀掺入少量农药，分装至小盆中浇足水。

（2）用干净的镊子将在培养皿里生长十天左右、长出一对真叶的拟南芥幼苗，小心移栽到小盆中。

（3）将小盆摆放在托盘中，浇水后盖上透明塑料盖，防止水分蒸发过快。将幼苗放在拟南芥温室培养，生长过程中需要勤去观察打理，注意预防虫害和病害。

1.2.1.4.2  移皿

（1）在超净工作台中放入镊子，打开紫外灯灭菌20分钟。

（2）点上酒精灯，把镊子烧红冷却后，将在培养基上生长十天左右、长出一对真叶的拟南芥幼苗，移栽到新的培养皿中。

（3）用封口膜封好培养皿后，放在拟南芥温室继续培养。

1.2.2  hpr突变体鉴定

1.2.2.1  CTAB法抽提拟南芥DNA

（1）试剂准备：1.5×CTAB、异丙醇、三氯甲烷（氯仿）、无水乙醇。

（2）取拟南芥叶片于1.5ml EP管中，放入干净的钢珠，用磨样机打磨成匀浆，加入600ul 1.5X CTAB溶液，在65℃烘箱中放置30-40分钟，每5分钟上下颠倒几次，混匀。

（3）在通风橱中加入500 ul 氯仿：异戊醇（24：1），然后用混匀器混匀15分钟。

（4）取相同数量的1.5 ml EP管，每管加入1 ml 无水乙醇，做好标记后，在-20℃冰箱中预冷。

（5）将充分混匀后的EP管用离心机离心，10000 r 离心10分钟，使有机相与液相分离。离心后，液体应该分为三层，上层透明为DNA溶液，中间白色为组织块，下层绿色为有机相。

（6）用移液枪吸取上层透明液体400 ul 加入已经预冷的无水乙醇的EP管中，上下颠倒混匀几次后，在冰箱中放30分钟到一个小时，使沉淀充分。

（7）12000 r 离心15分钟，取出后观察管壁上有无白色沉淀，小心倒掉上清，扣干，分别加入500 ul 75% 乙醇并将沉淀弹起。

（8）12000 r 离心5分钟，倒掉上清，扣干。

（9）12000 r，1分钟离心，用移液枪吸出残余液体，管盖打开，在超净台中吹干，直到沉淀呈半透明状。

（10）每管加入40 ul 纯水溶解，4℃保存。

1.2.2.2  PCR鉴定

在Tair网站上找到hpr突变体的基因组序列，然后将基因组序列粘贴到Primer网站设计引物。引物序列为：

引物序列

HPR-F GATCATGCAAAACCGACCGT

HPR-R TCTTCCAAATCTCCCCTTCTTCA

LB ATTTTGCCGATTTCGGAAC

设计好引物后，做PCR。PCR程序为：

PCR程序

94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃

5min 30s 30s 1min 5min

1.2.2.3  抽提拟南芥RNA

（1）试剂准备：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、DEPC 水 、75%乙醇（DEPC 水稀释）。 拟南芥hpr突变体鉴定及其对光环境的响应(4):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206220.html