1.8  构建pGBKT7-ZFP157“诱饵”表达载体

设计前引物ZFP157BD-F以及后引物ZFP157BD-R（表1），扩增ZFP157基因总长,将ZFR157利用酶切位点EcoRΙ和BamHΙ插入到酵母真核表达载体pGBKT7中的GAL4 DNA结合结构域（Binding domain, BD）编码框下游，两者进行融合，从而获得重组质粒pGBKT7-ZFP157。

表1 引物ZFP157BD-F和后引物ZFP157BD-R

Primer                          Sequence（5’   3’）

BD-ZFP157-F                  ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGAGCAGGGA

BD-ZFP157-R                  CCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGAGCTTCTC

1.9  构建于pGBKT7-ZFP157载体的目的DNA转化酵母菌AH109

1) 于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中划线接种酵母菌株AH109，30摄氏度环境下培养1-3周，至培养基中长出酵母单菌落。

2) 挑取直径为2~3毫米的酵母单菌落，接入1mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培养液中，剧烈振荡打散菌落，以使菌块分离。

3) 将细胞悬液接入10 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，置于摇床200 rpm、30摄氏度环境下培养过夜（16~18小时），至OD600≥1.5。

4) 取1mL的培养物转移至含10 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基的三角瓶中，使得OD600=0.2~0.3，于摇床200rpm、30℃环境下培养（约3小时），至OD600为0.4~0.6。

5) 用1.5mLEppendorf管收集转移3mL的酵母菌培养物，室温环境下12,000 rpm离心1分钟，弃上清液。

6) 加入1 mL TE缓冲液重悬洗涤酵母浮片状沉淀细胞，12,000 rpm室温环境下离心1 分钟，弃上清液。

7) 所得沉淀用微量TE/LiAc混合液重悬后即得酵母感受态细胞。

8) 煮沸单链DNA（Salmon sperm DNA，10 mg/mL）10分钟后立即进行冰浴。

9) 将10 µL（100 µg）煮沸的单链DNA依次加入至100 µL酵母感受态细胞中，充分混合均匀，再加入10µL欲转化的质粒充分混匀。

10) 加入600 µL PEG/LiAc混合溶液，剧烈振荡（增加转化效率），混合均匀后置于摇床200rpm、30摄氏度环境下培养半小时。

11) 于每个试管中加70 µL二甲基亚砜，充分混合均匀（过程中不要剧烈振荡，轻轻颠倒混匀即可）。

12) 42摄氏度热激15分钟后迅速冰浴2分钟。12,000 rpm离心1分钟，弃上清液，吸取100 µL Tris和EDTA缓冲液重悬沉淀细胞。

13) 将转化液（30~60 µL）均匀涂布于相应的固态营养缺陷培养基表面，30摄氏度倒置平板，培养3~5小时，待单菌落长出2~3毫米。