5 尖仙格 156011118081335 母 史宾格 仙萍立 枝藏尖 2017.10.19

6 尖仙结 156011118081336 母 史宾格 仙萍立 枝藏尖 2017.10.19

7 尖仙卉 156011118081337 母 史宾格 仙萍立 枝藏尖 2017.10.19

8 尖仙丽 156011118081338 母 史宾格 仙萍立 枝藏尖 2017.10.19

1.1.2  主要试剂

标准品VMA、HVA、MN、NMN、E、NE、DA盐酸盐，丹磺酰氯(DNS-Cl)均购自美国Sigma 公司；内标品MN-D3,VMA-D3和DHBA盐酸盐购自美国Medicalisotopes 公司 ；甲醇购自德国Merck 公司；甲酸购自上海阿拉丁生物化学科技公司。试验用水由Milli Q 纯水仪制备。所有试验用化学品和溶剂均为色谱级。

1.1.3  主要仪器 

Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD, LC-MS /MS液相色谱质谱联用仪检测系统，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) ，低温真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器公司)

1.2  方法

1.2.1  去势前血浆采集及检验

①将每只犬单独分笼饲养，抽取同时间段2 mL血浆；

②分别将血浆样本、标准品、内标品取出平衡至室温。取血浆250 μL加入内标400 μL，再加入乙腈200 μL混匀，11000 r/min 离心5 min；

③取上清，用1 mL 的移液枪转移0.7 mL 上清液到另外一个1.5 mL EP 管，在-80℃预冷冻后，用真空冷冻干燥器冻干2 h，剩余体积少于20 μL；

④依次向上述1.5 mL EP 管加入30 μL 0.1 M NaOH溶液和50 μL 丹磺酰氯乙腈溶液(4 mg/mL)，旋涡混合30 s，然后避光反应5 min；

⑤反应完后每管加入7 μL反应终止剂和20 μL 超纯水，旋涡混合30 s后，再次在11000 r/min 4 ℃下离心5 min，取上清液80 μL于96孔板准备液质上样分析。

色谱条件： 流动相A1 为1 %甲酸水溶液，流动相B1为乙腈(含1 %甲酸)；流速为

0.5 mL/min。按A1∶B1 =65%∶35% 等度洗脱。