1。4。1 comK基因的PCR鉴定 4

1。4。2 16S rRNA基因的PCR鉴定 5

1。5 pUB110质粒的提取 5

1。6 感受态细胞制备与验证 5

1。6。1 Spizizen转化法 5

1。6。2 转化子验证 6

2 结果与分析 6

2。1 菌落生长情况分析 6

2。2 鉴定结果分析 7

2。3 系统发育进化树分析 7

2。4转化子验证结果 8

2。5 转化子数目统计与分析 9

3 讨论 10

参考文献 10

致谢 10

附录 11

分离、鉴定能形成自然感受态的枯草芽孢杆菌引言

枯草芽孢杆菌单细胞呈短杆状、无荚膜、周生鞭毛、能运动,是芽孢菌株的模式菌株。枯草芽孢杆菌具有分布广、易分离等优点。一般土壤以及河湖地带都能分离出枯草芽孢杆菌。寡营养条件下、可自发形成感受态细胞。根据这一特性，枯草芽孢杆菌常用于外源DNA的转化。枯草芽孢杆菌因其特征性及优越性，广泛应用于工业、农业、医疗等领域，与人类关系密不可分[1]。

枯草芽孢杆菌的研究历史悠久。从最初的形态观察、鉴定分类到如今的分子生物学层面的研究，它给我们带来太多的惊喜与成果。传统的生理生化特征对枯草芽孢杆菌的分类与鉴定主要体现在菌落形态特征、显微镜下单细胞特征以及一些化学指标的测定。由于对枯草芽孢杆菌的多年研究，越来越来多的菌种被发现，表面性的鉴定方法已经显得比较无力。随着分子生物学的发展，人类发现不同菌种都包含特定的保守序列，这对于通过基因层面来鉴定菌种有重大意义。枯草芽孢杆菌作为工业酶的生产的主要菌种，它可以产生多种蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等，并且产量高、安全性好、抗逆性强[2]。枯草芽孢杆菌因为自身具有较强的抗病作用，所以在生物防治、医疗、环境保护方面也有广泛应用。

由于枯草芽孢杆菌自身能形成感受态细胞的特殊性质，可将外源蛋白质基因转化至自身的质粒DNA上，形成转化子细胞。转化子细胞具有编码外源蛋白质基因、翻译表达外源蛋白质产物的功能。细菌感受态转化主要包括吸附、断裂、吸收降解和重组。吸附发生在感受态细胞表面，此时感受态细胞对外源DNA有很大亲和力，使得DNA很容易进入细胞内。当外源双链DNA进入细胞之后，会被细胞内的核酸酶作用断裂。双链DNA的其中一条会发生降解，另外一条进入细菌后可与基因组DNA或者质粒DNA发生重组。如果外源DNA含有独立的复制子,则也可以产生转染子或质粒转化子。枯草芽孢杆菌感受态形成发生在对数生长后期，并且受到感受态信息调节素的调节[3]。在极端环境下感受态信息素分泌增多，当达到某一临界值时，激活晚期感受态基因的表达，而晚期感受态基因则负责细胞对外源DNA的吸收重组。

如果需要提高枯草芽孢杆菌重组载体的蛋白质分泌量，就有必要从自然界分离出转化效率较高的枯草芽孢杆菌。采用转化方法为Spizizen转化法[4]。本研究旨在分离出具有高效转化率的枯草芽孢杆菌，为日后构建优良重组载体提供参考。 分离鉴定能形成自然感受态的枯草芽孢杆菌(2):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_96685.html