本试验将通过混合磨样以及通过检测样品中Rc基因，建立起杂草稻向转基因水稻基因漂移率的检测技术，期望确定可检测到Rc基因的最佳磨样量和定量化检测标准，并将该技术运用于检测杂草稻WRMM和WRYY向转基因水稻T1c-19在相邻种植条件下的基因漂移率。该检测技术的建立将为杂草稻向转基因水稻基因漂移率的的检测提供高效、省时的方法。

1  材料与方法 

1．1  试验材料

复合性状转Cry1C*/Bar基因水稻T1c-19，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室和国家植物基因研究中心提供。选用的杂草稻WRYY和WRMM由试验室人员至湖南益阳和广东茂名采集。材料来源和主要特征见表1。

表1试验材料的来源和主要特征

Table 1 Origin and characteristics of transgenic rice and weedy rice accessions used in the experiment 

1．2  试验方法

1．2．1  最佳磨样量的确定  （1）不同粒数比样品总质量及取样量的确定

将杂草稻WRYY和转基因水稻T1c-19的种子脱壳后按照粒数比1: 10、1: 20、1: 30、1: 40、1: 50、1: 60、1: 70、1: 80、1: 90、1: 100混合，粒数比为1:10-1:50的混合样品在研钵中加入液氮研磨，1:60-1:100的混合样品使用广东小熊电器有限公司提供的磨豆机（型号MDJ-D4072）研磨，每种比例磨10份，使粉末均匀一致。若使用机器研磨的样品粉末研磨不充分，可将粉末在研钵中加入液氮进一步研磨，直至粉末均匀一致。分别称重，之后计算混合样品的平均重量。

提取DNA过程中在2 ml离心管中加入的样品体积占离心管总体积的四分之一，即0.5 ml刻度线处。因此，使用杂草稻与转基因水稻粒数比为1: 60时磨好的粉末装填至2 ml离心管的0.5 ml刻度线处，称量后记录去掉空离心管质量的数据。共称量10次，统计分析确定提取DNA时混合样品的取样量。

（2）DNA浓度的确定

从不同粒数比的混合样品中取出上一步试验确定的取样量用于提取DNA，之后对DNA浓度进行检测，每种粒数比的DNA浓度共检测10次，确定提取DNA的适宜浓度范围。DNA提取试剂盒为植物基因组DNA提取试剂盒（DP305），由天根生化科技（北京）有限公司提供。

（3）检测不同粒数比DNA中的Rc基因

采用李潇艳[32]设计的引物RED4：RED4-For:5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′,

RED4-Rev:5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′。根据该特异性引物对各粒数比的样品DNA进行扩增，每种粒数比扩增40次，扩增产物在6 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，每份样品上样量为5 μL，硝酸银染色后拍照。如果某一样品中同时检测到118bp和104bp的片段，则表明在该份样品中能够检测到Rc基因，代表样品中存在杂草稻向转基因水稻基因漂移产生的杂交种。通过电泳结果计算每种粒数比40份样品中检测到Rc基因的次数，以确定最佳磨样量。

PCR反应体系：共10μL （2× Taq PCR Mix 4 μL，ddH2O 4.5 μL，上下游引物各0.25 μL，DNA 1 μL）。PCR反应由TAKARA（TaKaRa PCR Thermal cycler）热循环仪完成。电泳仪（DYY-6D型）由北京市六一仪器厂提供，电泳条件为220V，1h。

1．2．2  定量化检测标准的确定    通过1.2.1确定了能检测到Rc基因时杂草稻和转基因水稻的最佳磨样量，之后设计在最佳磨样量中分别混入1粒、2粒、3粒、4粒、5粒和6粒杂草稻种子，脱壳混合后研磨成粉末，每种混合方式研磨4份备用。采用1.2.1中DNA提取的方法及Rc基因检测方法，观察在同一磨样量里混合不同粒杂草稻后Rc基因条带颜色的深浅，判断是否可以根据条带颜色的深浅确定同一磨样量里含有的杂草稻粒数，从而使检测标准定量化。 杂草稻向转基因水稻基因漂移率的检测技术及验证(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206223.html