2.2蛋白质特性分析

使用ProParam（http://web.expasy.org/protparam）计算NnMADS-box的分子量（MW）和等电点（pI）。

2.3引物设计与PCR扩增

根据MADS-box基因序列，在基因的3’端和5’端分别设计引物，引物扩增区域包括基因的全长CDS区。通过Primer Premier 5软件和Oligo 6软件两者相结合来设计PCR所需要的引物。PCR反应的体系和程序需要进行事先设计，以及之后的操作要按照Taq DNA聚合酶说明书进行。反应程序结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR所得产物，有效结果的标准为条带的大小与预期设计相符合，扩增出来的片段即为所需要的目的片段。并对目的片段进行切胶操作的回收和测序。 

2.4构建系统发育树

把已经鉴别和确定过的荷花、拟南芥、水稻三者的MADS-box基因利用MAFFT-7.037进行序列比对,并用FAST-TREE(默认参数)软件使用最大似然法来构建进化树。利用FigTreev1.4.3对系统进化树进行可视化显示及优化。

2.5转录组数据分析

本研究中使用的转录组数据包括不同的组织（PRJNA196884）和不同的根茎发育阶段（PRJNA285836），文库制备方法和测序数据统计在文献中均有详述。

使用SRA工具包转换为FASTQ格式后，使用Trimmomatic（V0.32），默认设置进行序列清理，包含poly-N和低质量序列（Q<20）。我们用Bowtie2索引荷花的基因组，并使用TopHat将Clean read比对到索引的基因组。表达水平通过Cufflinks程序（Cufflinks v2.2.142）进行分析，基因表达量以FPKM表示。

2.6植物材料处理，RNA提取和文库构建准备以及测序

荷花幼苗（荷花‘红晕蝶影’品种）在5月至8月南京的自然光照条件下生长。荷花的遮阴处理为通过70％遮阳网进行遮阴。三个独立实验至少每个重复三次，处理后对花芽进行取样，进行RNA提取、cDNA文库构建和测序。数据分析同2.5。

3 结果与分析 

3．1 鉴定荷花MADS-box基因

我们将从Pfam检索出的SRF（I型，M型）结构域（PF00319）和K-box（II型，MIKC）结构域（PF01486）用于HMMER 2.1.1软件包，鉴定荷花MADS-box基因。只有E值 <1e-5的序列被认为是该家族的成员。该筛查生50个荷花MADS-box（NnMADS-box）序列。50个NnMADS-box基因的信息列于表1中，这些性质除了蛋白质本身的长度和分子量，还有其等电点和保守序列的特征。鉴定的NnMADS-box基因编码长度为97（LOC104590131）至456（LOC104590545）的不同数量的氨基酸，平均为250个氨基酸。蛋白质重量范围为23.52 （LOC104590131）至111.85（LOC104590545）kDa。等电点（PI）从5（LOC104605862）到7.04（LOC104587563），其中49个pI <7，且仅一个NnMADS-box基因的pI> 7。MADS-box基因家族的数量在不同物种之间差异较大。在拟南芥中鉴定出了99个MADS-box基因， 水稻中有73个 MADS-box基因，在大豆中有164个，暗示MADS-box基因在经过全基因组重复事件后重复拷贝经常丢失。