1.材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1主要仪器与设备

本实验涉及到的仪器设备主要有：常规冰箱（海尔 BCD-290W）、-80℃冰箱（艾本德 U410-86）、台式超速离心机（德国Eppendorf 公司）、AG22331型PCR 仪（德国Eppendorf 公司）、无菌超净工作台（ESCO）、NanoDropTM 2000 微量测定分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）、台式高速离心机（Sigma1-14）、实时荧光定量PCR仪（Bio-RAD CFX96）、毛细管拉针仪（P-97，Sutter Instrument）、高压蒸汽灭菌锅、人工气候室等。

1.1.2主要试剂与药品

本实验使用到的试剂药品主要有：RNA抽提Trizol试剂盒购自Lifetech Scientific Corporation；DNA Marker DL2000、6×Loading buffer、cDNA第一链反转录试剂盒、T载体等购自大连TaKaRa公司；琼脂糖购自Sigma公司、实时荧光定量PCR试剂盒和八连管等均购自美国Bio-RAD公司；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒购买于德国Omega 公司；由上海英潍捷基有限公司完成常规和荧光实时定量PCR引物的合成和测序；琼脂糖、异丙醇、无水乙醇、氯仿、EDTA等常规试剂均购自国药集团。

1.2 褐飞虱虫源处理及水稻种植

从中国水稻研究所采集褐飞虱饲养种群，其后长期饲养于实验室人工气候室。褐飞虱饲养全部采用感虫水稻品种TN１。在温度（25±1）℃、相对湿度为（70±5）%和光周期14L:10D条件下，将水稻和褐飞虱均放在人工气候箱或者人工气候室中培育或者饲养。

从4龄褐飞虱开始选择同一批进行饲养，选取5龄第1天的褐飞虱若虫，进行InR基因RNA干扰实验。具体干扰内容为InR1、InR2单基因RNA干扰，InRs混合RNA干扰，以注射dsGFP作为对照组，各组注射量为体积100 nl含200 ng不同基因的dsRNA，在注射后48 h和72 h进行取材，并用于相关指标的检测。

1.3 实验方法

1.3.1双链 RNA（dsRNA）合成

（1）从NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站获取褐飞虱的两个胰岛素受体基因的序列，根据此序列选取一段长度适宜的特异序列并克隆在T载体上。

（2）用含T7启动子的正反引物在序列两端加上T7启动子序列，扩增至少50 μl体系，并以此作为 dsRNA 合成的模板。（具体引物及其序列见表1）

（3）制作1％琼脂糖凝胶，称取0.5 g琼脂糖粉末，溶解于50 ml超纯水中，用微波炉加热10 s，待琼脂糖粉末完全溶解后倒进制胶槽冷却。制胶完成后进行电泳。 

（4）用无菌手术刀切取凝胶中相应电泳片段，根据回收试剂盒说明书回收和纯化扩增产物，纯化完成后用无核酸酶的水将扩增片段溶解。

（5）检测模板的浓度和质量，在Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪上进行，并用1％的琼脂糖凝胶电泳进一步检测模板质量和条带大小。待检测的样本应置于冰盒中，以减少RNA的变性。

（6）根据Ambion T7 转录试剂盒说明书合成双链RNA，纯化的DNA模板用量为100-200 ng。

（7）在37℃的空气浴环境中，将合成体系静置反应16 h后取出。

（8）测定双链RNA的浓度，在Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪上进行。体系盐离子浓度和dsRNA浓度过高均可以对测定结果产生影响，若遇此情况，可将合成的dsRNA产物稀释10倍再检测。待检测的样本应置于冰盒中，以减少RNA的变性。

（9）检测合成dsRNA的质量和大小，同样用1％琼脂糖凝胶电泳进行。

（10）加1 μl TURBO DNase，在37℃环境下反应15 min，随后在65℃环境下反应10 min以终止反应。

（11）将以上步骤后所得dsRNA产物浓度调整到5 μg/μl。

（12）去除杂质，在4℃环境下，12,000 rpm离心5 min。 胰岛素受体基因InR调控褐飞虱海藻糖代谢研究(3):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_205576.html